Изобретение относится к микробиологии, а именно к определению контаминации пищевых продуктов. Способ включает приготовление мясо-пептонного агара, разлив его в чашки Петри, отбор проб с пищевых продуктов, приготовление взвеси из навески пищевых продуктов, приготовление десятичных разведений исследуемой взвеси и размещение десятичных разведений исследуемой взвеси в чашки Петри, культивирование и подсчет числа колоний по формуле: x=a n ×10, n - степень разведения. Причем для приготовления десятичных разведений исследуемой взвеси используют 0,6-0,8%-ный раствор мясо-пептонного агара, при этом десятичные разведения исследуемой взвеси размещают на мембранные фильтры, находящиеся на поверхности мясо-пептонного агара в чашке Петри. Способ является оригинальным в решении, простым в осуществлении, информативным, дает статистически достоверные результаты; позволяет значительно сократить расход питательных сред, стерильной бактериологической посуды и времени проведения анализа; позволяет дать реальную количественную оценку содержания микроорганизмов, дающих сливной рост и образующих очень мелкие колонии, а также позволяет изучать внутрипопуляционные процессы с использованием световой микроскопии. 1 ил., 1 табл.
Изобретение относится к области ветеринарно-санитарной экспертизы, санитарии и микробиологии, а именно к определению контаминации пищевых продуктов и санитарно-гигиенического состояния объектов внешней среды.
Наиболее близким является способ определения количества микроорганизмов в колбасных изделиях и продуктах из мяса в воде. Известный способ определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 г продукта заключается в следующем: приготовление раствора для разведения и мясо-пептонного агара для посева; проведение анализа; учет результатов. 1. Недостатком существующего способа является то, что используемый раствор натрия хлорида (0,85%-ный) для разведения проб незабуферен и изотоничен только по отношению к клеткам млекопитающих, а также для проведения анализов используется большое количество питательной среды, бактериологической посуды и затрат рабочего времени. Кроме того, этот метод не позволяет дать реальную количественную оценку содержания микроорганизмов, дающих сливной рост и образующих очень мелкие (росинчатые) колонии (Методы общей бактериологии. Под ред. Ф.Герхарда и др. М.: «Мир», 1983, с.442-512).
Задачей изобретения является снижение количества используемой питательной среды, бактериологической посуды и затрат рабочего времени путем использования физиологического раствора полужидкого МПА вместо 0,85%-ного раствора натрия хлорида с последующим высевом капли разведенной испытуемой взвеси на поверхность мембранного фильтра.
Применение данного способа основано на том, что в качестве физиологического раствора для разведения используется физиологический раствор полужидкого мясо-пептонного агара (0,6-0,8%), состоящий из 1 дм 3 дистиллированной воды, 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 0,3 г безводного КН 2 РО 4 , 0,6 г безводного NaH 2 РО 4 и 0,6-0,8 г агар-агара; рН среды 7,0-7,2, капли которого наносятся на поверхность мембранных фильтров.
Использование в качестве раствора для разведения (0,6-0,8% мясо-пептонного полужидкого агара) с последующим высевом капли разведенной испытуемой взвеси на мембранный фильтр является оригинальным в решении, простым в осуществлении, информативным, дает статистически достоверные результаты; позволяет значительно сократить расход питательных сред, стерильной бактериологической посуды и времени проведения анализа; позволяет дать реальную количественную оценку содержания микроорганизмов, дающих сливной рост и образующих очень мелкие (росинчатые) колонии, а также позволяет изучать внутрипопуляционные процессы с использованием световой микроскопии.
Для проведения анализа отбирают пробы пищевых продуктов согласно действующим нормативным документам (ГОСТ 18963-73. Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа. М., 1986; ГОСТ 9958-81. Изделия колбасные и продукты из мяса. М., 1982; ГОСТ 7702.2.1-95. Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. М., 1994).
Для приготовления взвеси навеску пищевых продуктов помещают в стерильную колбу (стакан) гомогенизатора и добавляют 0,85%-ный раствор натрия хлорида в четырехкратном количестве. Гомогенизацию проводят в электрическом смесителе. Вначале измельчают материал на кусочки замедленной скоростью вращения ножей, затем при 15000-20000 об/мин в течение 2,5 мин. Допускается при отсутствии гомогенизатора приготовление испытуемой взвеси в стерильной фарфоровой ступке путем растирания 20 г продукта с 2-3 г стерильного песка, постепенно приливая 80 см стерильного физиологического раствора. Для посевов на питательные среды стерильной градуированной пипеткой отбирают взвесь после 15 мин выдержки при комнатной температуре. 1 мл взвеси содержит 0,2 г продукта.
Мясо-пептонный агар разливают в стеклянные или пластмассовые чашки Петри (диаметром 9 см) и после того, как агар остынет, на его поверхности стерильным пинцетом размещают 5-6 мембранных фильтров. На схеме представлены основные этапы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов предлагаемым способом.
0,6-0,8%-ный физиологический раствор полужидкого МПА разливают по 9 см 3 в стерильные пробирки. Затем в 9 см 3 физиологическом растворе полужидкого МПА готовят десятичные разведения исследуемой взвеси. Для этого в первую пробирку с 9 см 3 полужидкого агара вносят 1 см 3 исследуемой взвеси, из первой пробирки, тщательно перемешав 1 см 3 исследуемой взвеси, переносят во вторую и т.д. 0,1 мл (1 каплю) разведенной культуры наносят на мембранный фильтр, расположенный на МПА в чашке. В одну чашку можно поместить по 5-6 капель агара с различными разведениями культуры. Капли агара с разведенной культурой застывают через 10-15 мин. После этого чашки Петри культивируют в перевернутом виде в термостате при 37°С в течение 48 часов. Для определения количества жизнеспособных бактериальных клеток проводят подсчет колоний в каплях агара.
Для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов число выросших колоний умножают на степень разведения культуры по формуле:
где x - количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов,
a - количество выросших колоний,
n - степень разведения.
Для количественной оценки содержания микроорганизмов, дающих сливной рост и образующих очень мелкие (росинчатые) колонии, а также для изучения внутрипопуляционных процессов с использованием световой микроскопии выросшие на мембранных фильтрах колонии фиксируют в парах 25%-ного глутарового альдегида 30-40 мин. Затем мембранный фильтр накладывают на поверхность предметного стекла и наносят на него несколько капель пропиленоксида. Мембранный фильтр становится прозрачным и в микроскоп или лупу можно считать даже очень мелкие (росинчатые) колонии и при необходимости проводить микрофотосъемку.
Способ поясняется на следующих конкретных примерах осуществления (см таблицу).
Условные обозначения: способ 1 - ближайший аналог
способ 2 - предлагаемый
Пример 1. Определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в вареной колбасе. Определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов проводили двумя способами: способ 1 (прототип) - Для проведения анализа мясо-пептонный агар разливают в стеклянные или пластмассовые чашки Петри (диаметром 9 см). Отбор проб пищевых продуктов проводили согласно действующим нормативным документам (ГОСТ 9958-81. Изделия колбасные и продукты из мяса. М., 1982). Для приготовления взвеси навеску пищевых продуктов помещали в стерильную колбу (стакан) гомогенизатора и добавляли 0,85%-ный раствор натрия хлорида в четырехкратном количестве. Гомогенизацию проводили в электрическом смесителе. Вначале измельчали материал на кусочки замедленной скоростью вращения ножей, затем при 15000-20000 об/мин в течение 2,5 мин. Для посевов на питательные среды стерильной градуированной пипеткой отбирали взвесь после 15 мин выдержки при комнатной температуре. 1 мл взвеси содержит 0,2 г продукта. Готовили 3 разведения исследуемой взвеси в физиологическом растворе натрия хлорида: физиологический раствор натрия хлорида разливают по 9 см 3 в стерильные пробирки. Затем в 9 см 3 физиологическом растворе натрия хлорида готовят десятичные разведения исследуемой взвеси. Для этого в первую пробирку с 9 см 3 натрия хлорида вносят 1 см 3 исследуемой взвеси, из первой пробирки, тщательно перемешав 1 см 3 исследуемой взвеси, переносят во вторую и т.д. и затем из каждого разведения по 0,1 мл наносили в чашку Петри (всего 3 чашки). После этого чашки Петри культивировали в перевернутом виде в термостате при 37°С в течение 48 часов. Для определения количества жизнеспособных бактериальных клеток проводили подсчет колоний в каплях агара. Для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов число выросших колоний умножали на степень разведения культуры по формуле:
где x - количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов,
a - количество выросших колоний,
n - степень разведения,
Способ 2 (предлагаемый) включает приготовление раствора для разведения (0,6-0,8%-ный физиологический раствор полужидкого МПА 0,6-0,8%-ный физиологический раствор полужидкого МПА) и мясо-пептонного агара для посева; проведение анализа; учет результатов.
Для проведения анализа мясо-пептонный агар разливают в стеклянные или пластмассовые чашки Петри (диаметром 9 см), после того как агар остынет, на его поверхности стерильным пинцетом размещают до 6 мембранных фильтров. Отбор проб пищевых продуктов проводили согласно действующим нормативным документам (ГОСТ 9958-81. Изделия колбасные и продукты из мяса. М., 1982). Для приготовления взвеси навеску пищевых продуктов помещали в стерильную колбу (стакан) гомогенизатора и добавляли 0,85%-ный раствор натрия хлорида в четырехкратном количестве. Гомогенизацию проводили в электрическом смесителе. Вначале измельчали материал на кусочки замедленной скоростью вращения ножей, затем при 15000-20000 об/мин в течение 2,5 мин. Для посевов на питательные среды стерильной градуированной пипеткой отбирали взвесь после 15 мин выдержки при комнатной температуре. 1 мл взвеси содержит 0,2 г продукта. Готовили 3 разведения исследуемой взвеси в физиологическом растворе МПА: 0,6-0,8%-ный физиологический раствор полужидкого МПА разливают по 9 см 3 в стерильные пробирки. Затем в 9 см 3 физиологического раствора полужидкого МПА готовят десятичные разведения исследуемой взвеси. Для этого в первую пробирку с 9 см 3 полужидкого агара вносят 1 см 3 исследуемой взвеси, из первой пробирки, тщательно перемешав 1 см 3 исследуемой взвеси, переносят во вторую и т.д. и затем из каждого разведения по 0,1 мл наносили на поверхность мембранного фильтра, расположенного на МПА в чашке Петри. Причем 3 разведения размещали в одной чашке Петри. После этого чашки Петри культивировали в перевернутом виде в термостате при 37°С в течение 48 часов. Для определения количества жизнеспособных бактериальных клеток проводили подсчет колоний в каплях агара. Для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов число выросших колоний умножали на степень разведения культуры по формуле:
где x - количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов,
a - количество выросших колоний,
n - степень разведения.
Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, определенное по способу 1 - (9×10 2) и по способу 2 - (10×10 2), существенно не отличалось.
Пример 2. Определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в мясе. Определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов проводили двумя способами: способ 1 (прототип) - Для проведения анализа мясо-пептонный агар разливают в стеклянные или пластмассовые чашки Петри (диаметром 9 см). Отбор проб пищевых продуктов проводили согласно действующим нормативным документам (ГОСТ 9958-81. Изделия колбасные и продукты из мяса. М., 1982). Для приготовления взвеси навеску пищевых продуктов помещали в стерильную колбу (стакан) гомогенизатора и добавляли 0,85%-ный раствор натрия хлорида в четырехкратном количестве. Гомогенизацию проводили в электрическом смесителе. Вначале измельчали материал на кусочки замедленной скоростью вращения ножей, затем при 15000-20000 об/мин в течение 2,5 мин. Для посевов на питательные среды стерильной градуированной пипеткой отбирали взвесь после 15 мин выдержки при комнатной температуре. 1 мл взвеси содержит 0,2 г продукта. Готовили 6 разведений исследуемой взвеси в физиологическом растворе натрия хлорида: физиологический раствор натрия хлорида разливают по 9 см 3 в стерильные пробирки. Затем в 9 см 3 физиологическом растворе натрия хлорида готовят десятичные разведения исследуемой взвеси. Для этого в первую пробирку с 9 см 3 натрия хлорида вносят 1 см 3 исследуемой взвеси, из первой пробирки, тщательно перемешав 1 см 3 исследуемой взвеси, переносят во вторую и т.д. и затем из каждого разведения по 0,1 мл наносили в чашку Петри (всего 6 чашек). После этого чашки Петри культивировали в перевернутом виде в термостате при 37°С в течение 48 часов. Для определения количества жизнеспособных бактериальных клеток проводили подсчет колоний в каплях агара. Для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов число выросших колоний умножали на степень разведения культуры по формуле:
где x - количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов,
a - количество выросших колоний,
n - степень разведения.
Способ 2 (предлагаемый), включающий приготовление раствора для разведения (0,6-0,8%-ный физиологический раствор полужидкого МПА и 0,6-0,8%-ный физиологический раствор полужидкого МПА) и мясо-пептонного агара для посева; проведение анализа; учет результатов.
Для проведения анализа мясо-пептонный агар разливают в стеклянные или пластмассовые чашки Петри (диаметром 9 см), и после того, как агар остынет, на его поверхности стерильным пинцетом размещают 5-6 мембранных фильтров. Отбор проб пищевых продуктов проводили согласно действующим нормативным документам (ГОСТ 9958-81. Изделия колбасные и продукты из мяса. М., 1982). Для приготовления взвеси навеску пищевых продуктов помещали в стерильную колбу (стакан) гомогенизатора и добавляли 0,85%-ный раствор натрия хлорида в четырехкратном количестве. Гомогенизацию проводили в электрическом смесителе. Вначале измельчали материал на кусочки замедленной скоростью вращения ножей, затем при 15000-20000 об/мин в течение 2,5 мин. Для посевов на питательные среды стерильной градуированной пипеткой отбирали взвесь после 15 мин выдержки при комнатной температуре. 1 мл взвеси содержит 0,2 г продукта. Готовили 6 разведений исследуемой взвеси в физиологическом растворе МПА: 0,6-0,8%-ный физиологический раствор полужидкого МПА разливают по 9 см 3 в стерильные пробирки. Затем в 9 см 3 физиологическом растворе полужидкого МПА готовят десятичные разведения исследуемой взвеси. Для этого в первую пробирку с 9 см 3 полужидкого агара вносят 1 см 3 исследуемой взвеси, из первой пробирки, тщательно перемешав 1 см 3 исследуемой взвеси, переносят во вторую и т.д. и затем из каждого разведения по 0,1 мл наносили на поверхность мембранного фильтра, расположенного на МПА в чашке Петри. Причем 6 разведений размещали в двух чашках Петри. После этого чашки Петри культивировали в перевернутом виде в термостате при 37°С в течение 48 часов. Для определения количества жизнеспособных бактериальных клеток проводили подсчет колоний в каплях агара. Для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов число выросших колоний умножали на степень разведения культуры по формуле:
где x - количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов,
a - количество выросших колоний,
n - степень разведения.
После культивирования в чашках Петри при 37°С в течение 48 ч количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, определенное по способу 1 - (8×10 5) и по способу 2 - (7×10 5) существенно не отличалось.
Из приведенных примеров видно, что при сравнительной оценке двух методов число КОЕ, определенное по предлагаемому способу, существенно не отличалось от такового при определении общепринятым методом. В тоже время разработанный метод имеет ряд преимуществ. Так, на определение количества жизнеспособных клеток по пяти видам образцов составили: по существующему - 98 мин; по предлагаемому методу - 48 мин. Затраты питательной среды составили по прототипу - 420 мл; по предлагаемому способу - 135 мл. Количество чашек Петри составило по прототипу - 28 штук; по предлагаемому методу - 9 штук.
Согласно техническому регламенту и ГОСТу требования по количеству бактерий или КМАФАнМ (количеству мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов) следующие:
Высший сорт – до 100 тыс. КОЕ /см 3 ;
Первый сорт – до 500 тыс. КОЕ /см 3 ;
Второй сорт – от 500 до 4 000 тыс. КОЕ /см 3 ;
КОЕ – это колониеобразующие единицы, то есть, живые клетки, из которых на питательной среде может вырасти колония.
Определение КМАФАнМ проводят следующими методами:
1. Классический (прямой ) метод : посев на плотные питательные среды.
2. Редуктазная проба – относится к экспресс-методам. Эта проба основана на том, что бактерии, развиваясь в молоке, выделяют фермент редуктазу, способный обесцвечивать органические красители, такие как, резазурин. Чем больше бактерий в молоке, тем больше они выделяют фермента, тем быстрее идет обесцвечивание молока.
3. По изменению электропроводности при развитии микроорганизмов на питательной среде на приборе «Бак Трак 4300».
Определение количества бактерий в молоке по редуктазной
Пробе с резазурином
Метод анализа относится к микробиологическим. Поэтому приотборе пробнадо соблюдать правила отбора проб для микробиологических анализов (ГОСТ Р 53430).
Ход анализа. В стерильную пробирку стерильной пипеткой отмерить 1 см 3 рабочего 0,014 % раствора резазурина, добавить стерильной пипеткой 10 см 3 молока. Закрыть пробирку стерильной резиновой пробкой, перемешать трехкратным переворачиванием и поставить в редуктазник при температуре 37+ 1 о С. Отсчет времени начинается с момента постановки пробирок в редуктазник.
Предварительную оценку результатов делают через 20 минут, окончательную - через 1,0 час, затем через 1,5 часа.
Если через 20 минут молоко обесцветилось, то в таком молоке микроорганизмов более 20 млн/см 3 , это 4 класс по редуктазной пробе, молоко приемке не подлежит, анализ на этом прекращают. Если молоко имеет какой-либо цвет, анализ продолжают.
Если через час молоко серо-сиреневого или сиреневого с серым оттенком цвета, то микроорганизмов в таком молоке менее 500 тыс./см 3 (1 класс по редуктазной пробе, первый сорт молока по ГОСТу).
Если через час молоко сиреневого цвета с розовым оттенком или розового цвета, то микроорганизмов в таком молоке от 500 тыс./см 3 . до 4 млн/см 3 (2 класс по редуктазной пробе, второй сорт молока по ГОСТу).
Если через час молоко белое или бледно-розовое, то микроорганизмов в таком молоке от 4 до 20 млн/см 3 (3 класс по редуктазной пробе, молоко приемке не подлежит).
Розовое кольцо на поверхности во внимание не принимают.
Если при выдержке пробирок в редуктазнике еще в течение получаса молоко по-прежнему остается серо-сиреневого или сиреневого цвета, то бактерий в таком молоке до 300 тыс./см 3 .
Характер микрофлоры сырого молока оценивается по: бродильной, сычужно-бродильной пробе и пробе на наличие мяслянокислых бактерий.
Бродильная проба
Проводится для определения характера микрофлоры сырого молока и качества молочного белка при кислотном свертывании (в основном в сыроделии).
Ход анализа. В чистые пробирки, ополоснутые 2-3 раза исследуемым молоком, наливают по 20 мл молока, закрывают ватными пробками и помещают в редуктазник при температуре 38+ 1 о С.
Через 12 часов хорошее молоко остается жидким или появляются первые признаки свертывания. Молоко низкого качества дает вспученный сгусток. Окончательный результат получают через сутки.
1 класс – сгусток плотный, ровный, без отделения сыворотки. На сгустке допускаются незначительные полоски. Микрофлора - молочнокислая, качество белка высокое.
2 класс – Сгусток с полосками и пустотами, заполненными сывороткой, слабое отделение сыворотки, мелкозернистая структура сгустка. Микрофлора представлена молочнокислыми микроорганизмами с небольшой примесью газообразующей микрофлоры (в основном дрожжи). Качество молочного белка удовлетворительное.
3 класс – Сгусток сжался с обильным выделением зеленоватой или беловатой сыворотки, крупнозернистый, в сгустке пузырьки газа. Микрофлора - в основном газообразующие бактерии. При стянутом сгустке могут быть гнилостные микроорганизмы. Качество молочного белка – плохое.
4 класс – Сгусток разорван, вспучен, пронизан пузырьками газа. Микрофлора - в основном газообразующая, присутствуют маслянокислые бактерии, могут быть гнилостные. Качество молочного белка очень плохое.
Сычужно-бродильная проба
Проводится для определения характера микрофлоры сырого молока и качества молочного белка при сычужном свертывании (в основном в сыроделии). По техническому регламенту молоко для производства сыра должно иметьI или II класс по сычужно-бродильной пробе.
Ход анализа. В большие пробирки наливают приблизительно по 30 см 3 молока, вносят 1 см 3 0,5 %-ного раствора сычужного фермента (0,5 г сычужного фермента растворить в 100 см 3 воды с температурой 30 о С), перемешивают и ставят в термостат с температурой 37-40 о С.
Доброкачественное молоко свертывается в течение 20 минут, а через 12 часов дает плотный сгусток (сырок) с прозрачной сывороткой. Результаты сычужно-бродильной пробы оценивают в соответствии с таблицей 5.
Таблица 5 –Оценка результатов сычужно-бродильной пробы
Задание 2:
1. Подогреть молоко до 30-35 о С. Определить органолептические показатели молока и группу чистоты.
2. Охладить молоко до 20 о С, определить титруемую и активную кислотность молока. Сравнить полученные значения со значениями, приведенными в таблице 6.
3. Выразить кислотность в граммах молочной кислоты. Записать результаты в таблицу 9.
